進行胜肽與蛋白質HPLC分析方法最佳化時，可從以下因素切入考量:
層析管柱 |
官能團與相對應的管柱膠體孔徑大小 ⇒ 根據胜肽和蛋白質的分子量大小和疏水性來選擇最適合之組合。 一般來說，大分子樣品使用大孔徑和低表面疏水性的層析管柱。 |
|---|---|
移動相 |
梯度首選0.1% TFA/acetonitrile條件 ⇒ 如果是有各種離子特性之混合物樣品，可調整 1) TFA濃度, 2) 酸種類 以及/或pH ⇒ 調整梯度條件 較大之蛋白質使用2-propanol可能有分離效果 |
溫度 |
溫度對改變分離選擇性或改善峰形有效果。但是，可用的溫度範圍受到層析管柱耐用性之限制。 （強酸性條件+加熱會加速官能團的降解=縮短滯留時間和/或增加不利於膠體和樣品之間的二次作用力） |
<<如何選擇逆相層析管柱>> <<Bioseparation Catalog>>
比較管柱不同孔徑與不同官能基差異對分離效果的影響
我們比較了分子量介於 4,300~17,000的蛋白質與胜肽樣品對於不同孔徑與不同官能基分離特性的比較。由以下圖譜觀察可以發現，適合這個分子量範圍的管柱為C8, 200 Å。若孔徑或是官能基選擇未進行最佳化，我們會觀察到較寬的峰型以及較差的解析度。使用適合樣品的管柱可以得到漂亮的峰型以及優越的分離結果。
1.Cytochrome c (MW 12,400)
2.Insulin (Bovine) (MW 5,700)
3.Amyloid β-protein (MW 4,300)
4.Lysozyme (MW 14,300)
5.α-Lactalbumin (MW 14,100)
6.Myoglobin (MW 17,000)
| Column | 5 μm, 150 X 4.6 mmI.D. |
|---|---|
| Eluent | A) water/TFA (100/0.1) B) acetonitrile/TFA (100/0.1) 25-60%B (0-20 min) |
| Flow rate | 1.0 mL/min |
| Temperature | 37°C |
| Detection | UV at 220 nm |
管柱溫度以及移動相的影響 (抗菌胜肽分離最佳化)
結構 (抗菌胜肽)
HPLC 條件
| Column | YMC-Triart C18 (1.9 μm, 120 Å), 50 X 2.0 mmI.D. |
|---|---|
| Flow rate | 0.4 mL/min |
| Detection | 220 nm |
管柱溫度影響
改變管柱溫度會改變選擇性並改善峰形。高耐用性層析管柱 Triart可提供更廣泛的使用溫度範圍。 溫度控制可用作方法最佳化的工具。
| Eluent | A) water/TFA (100/0.1) B) acetonitrile/TFA (100/0.1) 25-45%B (0-5 min) |
|---|
移動相酸類型、濃度以及梯度條件的影響 (於70°C)
我們也可藉由改變酸類型和/或濃度來改變選擇性。 當化合物的離子特性差異很大時，這是一個很有效的分離策略。
| Eluent | A) acid-containing aqueous solution B) acid-containing acetonitrile solution (0.1% HCOOH in B solution is 0.08%) |
|---|---|
| Temperature | 70°C |
添加2-propanol於移動相中
2-propanol添加於移動相中並梯度最佳化。改善了peak 1及peak 2的解析度並維持一樣的分離時間。
| Eluent | A) 0.1% formic acid in water B) 0.08% formic acid in organic solvent |
|---|---|
| Temperature | 70°C |
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