HILIC 分離的沖提順序與 RP 模式完全相反，使其成為分析親水性化合物的理想選擇。由於這些化合物在 HILIC 層析管柱上沖提較晚，因此這種分離模式非常適合分析親水性生物分子。
使用 YMC-Triart SIL 層析管柱可以分離四種不同的親水性雙肽，如此份新應用說明中所示。L-Carnosine和 L-anserine可在哺乳動物的肌肉和腦組織中找到。Gly-Gly 用於胜肽合成而 Gly-Asp 常見於代謝物。
YMC-Triart SIL 層析管柱對所有雙肽均表現出出色的分離度，即使對於結構相似的化合物 L-Carnosine和 L-anserine也是如此。在此處下載應用說明副本，了解如何在 4 分鐘內完成 HILIC 分離！
進行胜肽與蛋白質HPLC分析方法最佳化時，可從以下因素切入考量:
層析管柱 |
官能團與相對應的管柱膠體孔徑大小 ⇒ 根據胜肽和蛋白質的分子量大小和疏水性來選擇最適合之組合。 一般來說，大分子樣品使用大孔徑和低表面疏水性的層析管柱。 |
|---|---|
移動相 |
梯度首選0.1% TFA/acetonitrile條件 ⇒ 如果是有各種離子特性之混合物樣品，可調整 1) TFA濃度, 2) 酸種類 以及/或pH ⇒ 調整梯度條件 較大之蛋白質使用2-propanol可能有分離效果 |
溫度 |
溫度對改變分離選擇性或改善峰形有效果。但是，可用的溫度範圍受到層析管柱耐用性之限制。 （強酸性條件+加熱會加速官能團的降解=縮短滯留時間和/或增加不利於膠體和樣品之間的二次作用力） |
<<如何選擇逆相層析管柱>> <<Bioseparation Catalog>>
我們比較了分子量介於 4,300~17,000的蛋白質與胜肽樣品對於不同孔徑與不同官能基分離特性的比較。由以下圖譜觀察可以發現，適合這個分子量範圍的管柱為C8, 200 Å。若孔徑或是官能基選擇未進行最佳化，我們會觀察到較寬的峰型以及較差的解析度。使用適合樣品的管柱可以得到漂亮的峰型以及優越的分離結果。
1.Cytochrome c (MW 12,400)
2.Insulin (Bovine) (MW 5,700)
3.Amyloid β-protein (MW 4,300)
4.Lysozyme (MW 14,300)
5.α-Lactalbumin (MW 14,100)
6.Myoglobin (MW 17,000)
| Column | 5 μm, 150 X 4.6 mmI.D. |
|---|---|
| Eluent | A) water/TFA (100/0.1) B) acetonitrile/TFA (100/0.1) 25-60%B (0-20 min) |
| Flow rate | 1.0 mL/min |
| Temperature | 37°C |
| Detection | UV at 220 nm |
結構 (抗菌胜肽)
HPLC 條件
| Column | YMC-Triart C18 (1.9 μm, 120 Å), 50 X 2.0 mmI.D. |
|---|---|
| Flow rate | 0.4 mL/min |
| Detection | 220 nm |
改變管柱溫度會改變選擇性並改善峰形。高耐用性層析管柱 Triart可提供更廣泛的使用溫度範圍。 溫度控制可用作方法最佳化的工具。
| Eluent | A) water/TFA (100/0.1) B) acetonitrile/TFA (100/0.1) 25-45%B (0-5 min) |
|---|
我們也可藉由改變酸類型和/或濃度來改變選擇性。 當化合物的離子特性差異很大時，這是一個很有效的分離策略。
| Eluent | A) acid-containing aqueous solution B) acid-containing acetonitrile solution (0.1% HCOOH in B solution is 0.08%) |
|---|---|
| Temperature | 70°C |
2-propanol添加於移動相中並梯度最佳化。改善了peak 1及peak 2的解析度並維持一樣的分離時間。
| Eluent | A) 0.1% formic acid in water B) 0.08% formic acid in organic solvent |
|---|---|
| Temperature | 70°C |
胜肽(peptides)已成為最重要的生物製藥之一。這些分子的廣泛功能提供了多種藥物的應用。胜肽的化學性質取決於肽鏈的長度、胺基酸側鏈的組成以及分子的潛在二級結構和修飾。
因此，胜肽的大小和物理化學性質可能有很大的不同。這導致生產和製備純化的特殊要求。因此，必須找到最合適的純化策略來解決因此而產生的各種不純物組成。
儘管胜肽分子的生產來源為—合成(synthesis)或重組(recombinant)—藉用逆相層析進行純化是最常使用的，因為可以很容易地分離胜肽的結構變體(structural variants)甚至較小的胜肽中單個胺基酸差異。本文件是在考量經濟效益和生產方面的情形下發表此開發製備型胜肽純化策略指南。這意味著：在成本限制之下於最短循環時間內達到最大的樣品回收率。著重於將毫克級放大到克級產量，而生產規模可達到公斤級甚至噸級產量。製備級LC全面的方法開發通常是以線性放大方法計算，它包括以下步驟：
1.分析級方法開發
2.分析級進樣量測試
3.放大至製備級純化
4.法規事務支援
YMC提供了各種不同材質(C18, C8, C4…等)、粒徑(50~10µm, 7µm…等)、孔徑大小，協助客戶各種不同方法條件篩選，甚至可應用於全水相以及鹼性條件的應用。詳細內容請來信與我們討論或索取原文說明資料。
原文出處：Strategic peptide purification by YMC EUROPE(請來信索取)
相關應用資料：
Peptide純化放大案例應用資料(以Liraglutide為例)(請來信索取)
Application of amino acids/peptide/protein如未列出您所需要分析物，請來信與我們討論取得最新應用!
連續式純化胜肽生產，案例說明tetracosactide，歡迎至我們的客戶BACHEM發佈的youtube影片連結了解詳情(如影片連結失效，請與我們聯繫)。
另有Liraglutide 連續式純化MCSGP應用，請來信與我們討論取得最新應用!
我們新增了莫奈拉韋(Molnupiravir)與大麻素(Cannabinoids)HPLC分析方法!
應用資料如下:
莫奈拉韋(Molnupiravir)
大麻素(Cannabinoids)
使用管柱為YMC-Triart C18
我們新增了Budesonide (JP/USP) 藥典分析方法!
(Epimer B of Budesonide/Epimer A of Budesonide)
應用資料如下:
Budesonide (The draft for the Japanese Pharmacopoeia)
Budesonide (The draft for the Japanese Pharmacopoeia)
Budesonide (The United State Pharmacopeia)
使用管柱為YMC-Pack ODS-A
核酸治療劑，如: 沉默RNA(silencing RNA duplexes, siRNA)、信使 RNA(messenger RNA, mRNA)和反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides, ASO)是用於多種疾病的藥物治療極具前景的候選藥物。 治療性寡核苷酸通常經過修飾以增強其穩定性或改善藥代動力學(pharmacokinetics)，並可以由骨架(backbone)、鹼基(base)或糖部分的修飾(sugar moieties)以及結構的共軛(conjugatetion)來分類[1]。 通常，寡核苷酸具有磷酸二酯鍵(phosphodiester linkages, PO)。最常見的修飾之一是用硫取代氧原子，從而形成硫代磷酸酯鍵(phosphorothioate linkage, PS)。這種 PS連接可增加對核酸酶的穩定性並防止核酸降解。 PS 寡核苷酸通常用於體內和體外技術，因為它們比 PO 更穩健。
另一個經常進行的修飾是將 2′-ribose位置的親核羥基部分替換為 O-methyl (2′-OMe) 基團。 這進一步增加了對核酸酶降解的穩定性。
由於寡核苷酸骨架中帶負電荷的磷酸基團，通常使用陰離子交換 (AEX) 進行分析。 YMC 的無孔陰離子交換管柱 BioPro IEX QF 有一個Quaternary amine殘基作為官能基團。 BioPro IEX QF 的無孔顆粒提供高效率和高解析度的分離效果。
在文章內容中，針對單鏈未修飾和修飾的 DNA 和 RNA進行了不同的最佳化步驟，以凸顯方法效率的重要性。第一組樣品涵蓋具有不同長度（20 和 21 mers）的 PO 鍵的單鏈 DNA 和 RNA，因為 N-1（短鏈）和 N+1（長鏈）是寡核苷酸純化過程中最常見的不純物。 該組樣品還包含具有單個鹼基差異的單鏈 DNA。 第二組樣品處理 PS 鍵連接的單鏈 DNA 和 RNA。藉由改變緩衝溶液的鹽類型和濃度或修改梯度，以減少峰拖尾(peal tailing)和殘留(carryover)。
逆相 HPLC 已廣泛用於合成寡核苷酸的分析和純化。由於在一般逆相層析管柱上難以滯留和分離短寡核苷酸等高極性化合物，因此用於這些分離的層析管柱必須有一些特殊性質。包括在 100% 水相中的穩定性、高溫穩定性和更大孔徑等需求。
YMC 提供一系列用於寡核苷酸分析的色譜柱：YMC-Triart C18、YMC-Triart Bio C18、YMC-Triart C8 和 Hydrosphere C18。 YMC-Triart 系列由於其應用廣泛的膠體設計，可於方法開發中提供更靈活的選擇。而二氧化矽膠體材質的 Hydrosphere C18 對極性化合物具有很強的滯留能力。 對於各種固定相的不同孔徑選擇，也是一個重要因素，因為孔徑會影響寡核苷酸的擴散率，從而影響峰形。
在文章內容中，我們將探討如何提升寡核苷酸於ion-pairing逆相層析中的分離效果。
詳細應用資料內容歡迎來信與我們索取(info@ymctaiwan.com)或與我們進一步討論。
原始文章出處：How to optimize your oligonucleotide analysis from YMC Europe.
一篇關於連續式層析技術文獻發表於Journal of Chromatography A.
文獻標題：Purification of a GalNAc-cluster-conjugated oligonucleotide by reversed-phase twin-column continuous chromatography
作者：Richard Weldon ᵇ, Jörg Lill ᵃ, Martin Olbrich ᵃ, Pascal Schmidt ᵃ, Thomas Müller-Späth ᵇ
a) F. Hoffmann-La Roche Ltd., b) ChromaCon AG
詳細內容請參考以下文獻資訊與連結：
Journal of Chromatography A, Volume 1663, 25 January 2022, 462734
https://doi.org/10.1016/j.chroma.2021.462734
在進行大型純化生產前，通常需要於實驗室進行小量純化條件之方法開發與測試，YMC客戶使用了5mmID 玻璃管柱建立抗體純化方法開發平台並成功放大(scale up)至生產等級。詳細內容請參考這篇應用說明。
近年來發現PFAS可能會殘留於人類的血液以及器官中，我們摘錄了發表文獻中使用YMC Triart C18管柱結合online-SPE LC-MS/MS之檢測方法。
Polyethylene glycol(PEG)因其生物相容之特性，廣泛應用於藥物、生物醫藥及產業領域。常見於胜肽、蛋白質及其他治療藥物之應用。對於PEGylated protein之特性分析可能非常複雜並且需要使用各種不同的方法。
YMC於美國與Pelican Expression Technology實驗室合作開發出使用YMC-BioPro陽離子交換樹脂管柱進行PEGylated protein charge-variant之應用，展現出YMC BioPro管柱為此應用提供一穩定且再線性佳之分析工具，並優於目前分析charge-variant之方法。
更多詳細內容請參考LCGC雜誌內容：
The Utility of Cation Exchange Column for Successful Charge-Variant Analysis of PEGylated Proteins
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