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YMC Contichrom Twin CaptureSMB 為雙親和管柱系統，適用於從實驗室(bench)到生產規模(production scale)的抗體純化。

Image credit: YMCCo, Ltd.

生物製劑製造商的另一個常見問題是親和管柱與目標生物分子(target biomolecules)的結合效率僅為 40-60%。當推動層析管柱以達到更高的負載時，目標分子往往會直接穿過層析管柱而未被捕獲(uncaptured)。為了解決這個問題，YMC Contichrom Twin CaptureSMB系統串聯兩支親和管柱，這意味著第二支管柱可以捕獲任何通過第一支管柱的目標分子，有效地使第一支管柱的效率達到 95% 或更高。

Gach表示：「YMC系統允許當第二支層析管柱仍在進樣時，第一支層析管柱獨立出流路進行樣品洗脫(eluted)。當第一支層析管柱洗脫完成時，會自動接回流路並獨立出第二支層析管柱進行樣品洗脫。並一直持續這樣的程序。」 這種雙管柱系統已被證明可將產率提高多達三倍，同時相較於傳統批次式製程，只使用約一半的緩衝液和Protein A樹脂。

採用 YMC 技術的製藥公司包括 Bristol-Myers Squibb，該公司已將 YMC Contichrom Twin CaptureSMB 引入其某些抗體療法的臨床生產中⁶。一家總部位於歐盟的生物製藥公司也購買了雙管柱系統用於優良製造規範生產(good manufacturing practice production)， 以及多間歐洲和美國的客戶於試生產(pilot scale)使用⁷。

YMC 還有其姊妹技術 Contichrom Twin MCSGP HPLC，旨在連續式純化其他生物分子，例如胜肽(peptide)、抗體-藥物複合體(antibody-drug conjugates)和寡核苷酸(oligonucleotides)。

分子篩層析 SIZE-EXCLUSION CHROMATOGRAPHY

SEC按體積尺寸大小對生物分子進行分離，是一種常用來檢測和觀察聚集體(aggregate)的形態的品質控制方法。 在生產和儲存過程中，生物分子有結塊的趨勢，形成二聚體(dimer)和三聚體(trimer)甚至更大的聚集體。Cinzia Stella*表示：「聚集體會導致免疫原性(immunogenicity)，我們使用分子篩層析來監控尺寸變異的程度，以確保批次的一致性和產品品質。」

* Cinzia Stella , Senior Scientist in the protein analytical chemistry department at Genentech

用於 SEC 的樹脂(Resin)是高度多孔性(porous)的。 生物分子的大小決定了它是否可以穿透至孔隙中以及多深。由此決定了它從樹脂上洗脫(eluted)的速度。Takashi Sato*表示：「較大的分子無法進入孔隙，只能直接通過層析管柱，而較小的分子則深入孔隙並較晚被洗脫出來。”YMC in Japan 銷售和營銷經理 說。

*Takashi Sato, Sales and Marketing Manager at YMC in Japan

YMC有兩種適用於生物分子的 SEC產品：YMC-Pack Diol 和 YMC-SEC MAB。 第一種有四種孔徑。 60 Å適用於分離較小之生物分子。120、200 和 300 Å 層析管柱適用於分離蛋白質。第二種有 250 Å孔徑，專門設計用於檢測單克隆抗體和抗體-藥物複合體的聚集體和片段。

製造平台是一套完善的流程，適用於一系列產品。這些平台技術在生物製藥製造的大多數階段越來越受歡迎，包括 SEC。例如，適用所有的單克隆抗體使用相同層析管柱和流動相的例行性 SEC 分離方法。Stella 表示：「我們長期以來一直在研究 [免疫球蛋白 G 抗體(immunoglobulin G antibodies)]，我們嘗試盡可能多地使用適合我們大多數分子的平台方法。如果可以將相同的方法用於盡可能多的免疫球蛋白 G 抗體產品，而不必每次都開發和驗證新的方法，那麼品質管理實驗室的工作就會變得容易得多。」

然而，平台技術不是靜態的。Stella 表示：「我們緊跟最新的分析技術，如果我們發現有另一種層析管柱比我們目前使用的層析管柱更好，那麼我們會盡可能嘗試更改。」

離子交換層析 ION-EXCHANGE CHROMATOGRAPHY

Kakaley 表示：「離子交換層析對於大多數生物製劑的分析分離和製備純化都很有用。」 這種層析模式經常用於單株抗體的批次式第二步純化，用於親和層析之後。

IEX 層析是根據生物分子整體表面電荷(surface charges)的差異來分離生物分子。該樹脂含有帶電基團(charged groups)，可與生物分子表面的帶電氨基酸側鏈形成可逆相互作用。接著利用鹽濃度或 pH 梯度將這些物質從管柱中洗脫出來。

鹽離子與生物分子競爭樹脂上的帶電基團。這意味著隨著流動相中鹽濃度的增加，生物分子將開始脫離樹脂並從層析管柱中洗脫。 具有最低淨電荷(lowest net charge)的蛋白質將首先被洗脫，具有最高淨電荷(highest net charge)的蛋白質最後被洗脫。

對於 pH 梯度，洗脫順序取決於被分離的生物分子的等電點(isoelectric point)。等電點是生物分子上的帶電基團相互抵消時的 pH 值，使該生物分子的總電荷為零。例如，對於陽離子樹脂，當流動相的 pH 值低於生物分子的等電點時，它的總電荷將為正電荷並與樹脂結合。 當流動相的 pH 值升至等電點以上時，生物分子的整體表面電荷將為負； 它將被樹脂排斥並從層析管柱中洗脫。

YMC生產專為蛋白質、胜肽和核酸的 IEX 層析法的親水聚合物珠：YMC BioPro IEX。它可用作陽離子樹脂和陰離子樹脂。這兩種類型各有多孔和無孔的形式產品。多孔樹脂提供了更好的分離的可能性，但同時也要考慮較慢的流速。Sato表示：「非多孔性樹脂特別適合快速分析之應用。」

所有 YMC BioPro IEX 樹脂均有提供分析級層析管柱(analytical chromatography columns)和製備級純化分離(preparative-scale separations)的材料(bulk materials)。

YMCBioPro IEX 樹脂是專為蛋白質、胜肽和核酸的 IEX 層析而定制的親水性聚合物珠。

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疏水性作用層析HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY

HIC 利用表面疏水性的差異來分離生物分子。這種模式經常使用在生物分子粗產物純化生產過程的第三步，在親和層析(affinity)和離子交換層析(IEX)之後。

HIC 樹脂含有疏水基團，可與生物分子表面的胺基酸疏水側鏈形成可逆作用。在分離過程中使用鹽類梯度。高鹽濃度會加強生物分子和層析管柱之間的作用力，而較低的鹽濃度則會削弱此作用力。整個生物分子的疏水性越強，促進其結合所需的鹽類就越少。在分離過程中鹽濃度會從高到低，這表示疏水性最低的生物分子會先洗脫(eluted)，疏水性最強的生物分子最後洗脫。

這種層析模式在抗體-藥物複合體的品管分析越來越受歡迎。抗體-藥物複合體是單株抗體上藉由化學鍵結的小分子藥物所組成。所需的藥物與抗體比率因治療而異，但平均三或四個分子與單個抗體鍵結的藥物是一個常見的比率⁸。如果平均比率太低，療效可能會降低，但過高的比例可能會導致服用過量。因此，在所有抗體-藥物複合體的生產過程中，該比率的分析是關鍵的品質控制步驟。

Stella 表示：「我們通常使用 HIC 來分析抗體-藥物複合體的藥物與抗體比率。」基因泰克生產的Kadcyla是一種 HER2-陽性轉移乳腺癌的治療藥物，該藥物於2013年2月獲得 FDA 批准，成為首批上市的抗體-藥物複合體之一。

HIC 適用於抗體-藥物複合體分析，是因為大多數小分子藥物是疏水性的。未結合藥物的抗體會先從層析管柱上洗脫，而連接了最多藥物分子的抗體最後洗脫。比率可以藉由峰面積(peak areas)來確認。

與其他競爭者之層析管柱相比，BioPro HIC BF層析管柱可得到傑出的解析度(resolution)，並且對於判斷抗體-藥物複合體的藥物與抗體比率非常好用。

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2018年，YMC 推出了 YMC BioPro HIC BF材質，針對抗體-藥物複合體、抗體和其他蛋白質分析以及實驗級純化進行最佳化。Sato表示：「我們目前正積極開發另一種新的 HIC分離管柱以實現更快速的分離。」

逆相層析REVERSED-PHASE CHROMATOGRAPHY

RP層析的基本原理與HIC相同。固定相膠體上的疏水官能基團與生物分子表面的疏水官能基團(可逆性)結合。利用有機溶劑的濃度梯度按照生物分子的疏水性強度從管柱上洗脫出生物分子。

然而，用於逆相層析的膠體通常比 HIC樹脂疏水性更強。這導致生物分子和樹脂之間的相互作用更強，需要非極性有機溶劑（如：乙腈）來破壞鍵結並洗脫生物分子。

歷史上，逆相層析不常用於分離大生物分子。 洗脫這些物質需要傳統（純矽膠）逆相層析柱無法承受的條件。導入具有更強化學耐受性的混層樹脂材料(Hybrid resin materials)使這些分離成為可能。例如，近期發表的 YMC-Triart Bio C4 是一種300 Å 多孔性混層樹脂，專為利用RP分離完整單株抗體和其他大蛋白質而設計。

使用混層樹脂的RP層析法也是分離小生物分子的常用工具，YMC-Triart Bio C18專為此目的而設計。YMC-Triart Bio C4和YMC-Triart Bio C18 系列採用 1.9、3 和 5 µm 粒徑生產，可用作分析和半製備級層析管柱。這些層析管柱也非常適合用於胜肽圖譜(peptide mapping)鑑定，這是一種很重要的蛋白質結構確認方法。

結論CONCLUSION

生物製劑將繼續發展。 單株抗體復邁（Humira, 一種由艾伯維（AbbVie）生產的自身免疫性疾病治療藥物）多年來一直是全球最暢銷的藥物。它在 2018 年的全球銷售額為 199 億美元，預計將在 2023 年美國專利到期之前保持其頭把交椅⁹。另一種單株抗體—默克公司(Merck & Co.)的癌症免疫療法 Keytruda的銷售額預計將超過它。

近年來獲得 FDA 批准的生物製劑類型已從單株抗體擴展到包括更複雜的設計，例如抗體-藥物複合體。與此同時，生物分子製造正在從批量生產轉向連續式生產。層析製造商正在跟上產業變化的步伐，不斷發展樹脂(Resin)並發表適用於有效生物治療浪潮的新型層析設備。

REFERENCES

1. Lisa Urquhart, “Top Drugs and Companies by Sales in 2018,” Nat. Rev. Drug Discovery, 18 (2019): 245, https://doi.org/ 10.1038/d41573-019-00049-0.

2. Lisa M. Jarvis, “The New Drugs of 2019,” Chemical & Engineering News, Jan. 17, 2020,https://cen.acs.org/pharmaceuticals/drug–development/new– drugs-2019/ 98/ i3.

3. “Building Biologics,” Genentech, Feb. 8, 2016, https:// www.gene.com/stories/building–biologics.

4. Randi Hernandez, “Supplement: Integrated Continuous Manufacturing of Biologics,” Genetic Engineering and Biotechnology News, Sept. 14, 2017, https:// www.genengnews.com/magazine/ 300/supplement-integrated-continuous–manufacturing-of-biologics/ .

5. Ned Pagliarulo, “Pharma’s Slow Embrace of Continuous Manufacturing,” BioPharma Dive, Sept. 24, 2018, https:// www.biopharmadive.com/news/pharmas-slow-embrace-of-continuous-manufacturing/ 532811/ .

6. James Angelo et al., “Scale-Up of Twin-Column Periodic Countercurrent Chromatography for MAb Purification,” BioProcess International, April 20, 2018, https:// bioprocessintl.com/ 2018/april-2018/scale-up-of-twin-column-periodic-countercurrent-chromatography-for-mab-purification/ .

7. Kathleen Mihlbachler, Lindsay Arnold, and Jared Steffy, “Continuous Capture Chromatography as Part of an Integrated Downstream Purification Platform for mAbs” (poster presentation, PREP Symposium, Baltimore, July 7, 2019), https:// www.ymcpt.com/sites/default/ files/ PREP%20Poster%20AZ%20YMC%20Twin.pdf.

8. Xiuxia Sun et al., “Effects of Drug-Antibody Ratio on Pharmacokinetics, Biodistribution, Efficacy, and Tolerability of Antibody-Maytansinoid Conjugates,” Bioconjugate Chem. 28, no. 5 (2017): 1371–81, https://doi. org/10.1021/acs.bioconjchem.7b00062.

9. Sarah Houlton, “Back to Basics,” Chemistry World, Dec. 12, 2019, https://www.chemistryworld.com/news/pharmaceuticals–roundup–2019/ 4010812. article.